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标题: 一文了解原核蛋白表达(二) [打印本页]

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作者: avisup2    时间: 3 天前
标题: 一文了解原核蛋白表达(二)
一文了解原核蛋白表达(二)

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作者: drmad    时间: 3 天前
一文了解原核蛋白表达(二)
在上一文中，我们介绍了原核蛋白表达中载体的选择，特别是质粒载体的相关要点。接下来，我们将继续深入探讨表达菌株的选择，这是原核蛋白表达中另一个至关重要的环节。
2.2.3 表达菌株的选择
在原核蛋白表达系统中，大肠杆菌是最常用的表达宿主。然而，不同的大肠杆菌菌株具有不同的特性和应用场景，因此选择合适的表达菌株对于提高蛋白表达效率和产量至关重要。

BL21系列
BL21感受态细胞：BL21是一种缺失内源性蛋白酶的大肠杆菌B菌株，能有效避免重组表达蛋白的降解，广泛用于重组蛋白的表达。它适合依赖于大肠杆菌RNA聚合酶的原核系统的表达（如pGEX、pMAL等）。但该菌株不表达T7 RNA聚合酶，因此不适合于T7启动子驱动的蛋白表达（如原核表达载体pET系列）。

BL21(DE3)感受态细胞：BL21(DE3)是大肠杆菌BL21被λ噬菌体DE3溶原化所得到的感受态细胞，它含有T7 RNA聚合酶基因，该基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子。这使得BL21(DE3)成为高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因的优选菌株。其转化效率可达10^7cfu/µg。

BL21(DE3)PLysS感受态细胞：BL21(DE3)PLysS菌株携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性，并能表达抑制T7 RNA聚合酶的T7溶菌酶。这可以有效抑制T7 RNA聚合酶在目的蛋白被IPTG诱导前的本底表达，特别适合于表达影响细胞生存和活力的外源毒性蛋白。

Rosetta系列
Rosetta(DE3)感受态细胞：Rosetta(DE3)是在大肠杆菌BL21(DE3)基础上携带额外质粒所得衍生菌株。该质粒含有一个氯霉素抗性基因，且可转录产生识别6种大肠杆菌稀有密码子的tRNA。这使得Rosetta(DE3)能够大大提高带有真核基因特异的稀有密码子的真核基因在大肠杆菌中的表达水平。

Rosetta2(DE3)感受态细胞：Rosetta2(DE3)是BL21的另一种衍生菌株，它导入了具有氯霉素抗性的pRARE2质粒，该质粒可补充大肠杆菌缺乏的7种稀有密码子对应的tRNA。这使得Rosetta2(DE3)在提高外源基因表达水平方面更为出色，特别适用于表达含有稀有密码子的真核蛋白。

OrigamiB(DE3)感受态细胞
OrigamiB(DE3)菌株遗传突变了宿主的硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶基因，有助于重组蛋白正确折叠并增强蛋白的可溶性。这使得OrigamiB(DE3)成为富含二硫键重组蛋白表达的首选菌株。
TOP10菌株
TOP10菌株来源于MC1061菌株，是目前实验室最常用的菌株之一。它广泛用于基因克隆、蓝白筛选、质粒稳定扩增等分子生物学实验。TOP10菌株生长速度较快，且当转化产物为真核细胞来源的、甲基化的DNA分子时，可优先考虑使用。
DH5α感受态细胞
DH5α是实验室最为常用的大肠杆菌菌株之一，也广泛用于基因克隆、蓝白筛选、质粒稳定扩增等实验。DH5α菌株缺失核酸内切酶，提高了质粒DNA的产量和质量；同时，其重组酶缺陷型减少了插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性。
JM109感受态细胞
JM109(DE3)菌株来源于JM109，其染色体上携带IPTG响应的噬菌体T7RNA聚合酶表达序列，适合含有T7启动子的pET系列、pGEX、pMAL等蛋白表达系统。然而，JM109(DE3)菌株不可用于蓝白斑筛选试验。

3. 常规蛋白表达流程
在原核蛋白表达中，常规的蛋白表达流程包括以下几个步骤：

基因构建：采用合成、无缝克隆、酶切连接等方式将目的基因连接到合适的载体上。
转化感受态细胞：将构建好的质粒转化到选定的表达菌株中，如BL21系列等。
筛选阳性克隆：在含有适当抗生素的培养基上培养转化后的宿主细胞，筛选出阳性克隆。
小规模表达实验：从筛选得到的阳性菌落中挑选一些进行小规模表达试验，通过诱导表达载体中的目标基因来实现蛋白表达。
蛋白表达：在确定最佳表达条件后，通过大规模培养宿主细胞来表达目标蛋白。
蛋白提取：收集表达宿主细胞，利用细胞破裂、超声波或其他方法将目标蛋白从细胞中释放出来。
纯化目的蛋白：使用合适的纯化方法将目标蛋白从混合物中分离出来。
蛋白质分析：对纯化的目标蛋白进行分析，包括测定蛋白的浓度、鉴定其纯度和结构等。

综上所述，选择合适的表达菌株和遵循规范的蛋白表达流程对于提高原核蛋白表达效率和产量至关重要。希望本文能为读者在原核蛋白表达方面提供有益的参考和帮助。

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