摘要
基于心脏细胞分化认知，干细胞细胞疗法在心肌梗死（MI）治疗中显潜力，但心内膜细胞（ECCs）的具体作用尚未明确。该研究验证人胚胎干细胞（hESC）衍生 ECCs（hESC-ECCs）的心肌保护作用：先构建 GelMA/SilMA 光敏互穿网络水凝胶作为细胞递送系统，装载分选后的 hESC-ECCs，注入心梗大鼠心包腔。结果显示，递送的 hESC-ECCs 改善心梗后心功能、延缓毛细血管萎缩；机制上，其可在氧化应激下保护心肌细胞线粒体，还可能促进心脏内皮细胞血管生成。研究表明，hESC-ECCs 具有治心肌梗死潜力，机制为维持心肌细胞存活与促血管生成。
研究内容
一、水凝胶递送系统的制备与表征
该研究采用的互穿网络水凝胶由GelMA和SilMA组成（图1A）。为确定最佳配比，分别在含0.25% LAP的LI-APEL培养基中配制10% GelMA和8% SilMA溶液，按体积比1:1、1:2和2:1混合后进行后续测试。
采用流变仪评估IPN水凝胶与大鼠心脏的力学性能（图1B），由10% GelMA: 8% SilMA＝1:2（终浓度为3.3% w/v GelMA和5.3% w/v SilMA）的IPN水凝胶的损耗模量（G”）和储存模量（G’）均低于100 Pa（图1C和D），表明该水凝胶呈现近流体状态且以粘性行为为主导。该水凝胶的剪切模量与振荡扭矩与大鼠心脏参数基本一致（图1E和F），且在变形过程中产生的剪切应力极小。此外，其损耗因子高于另两种水凝胶（图1G），表明其具有更高粘度。
降解性关乎水凝胶植入后的清除能力，直接影响其安全性。体外实验显示，水凝胶在胶原酶II溶液中30天降解率达80%（图1H）。通过扫描电子显微镜观察到水凝胶内部结构。GelMA的孔径约为120 μm，SilMA为70 μm。两者混合后仍保持多孔结构，孔径分布范围扩展至250-300 μm（图1I和K）。
最终选定3.3%（w/v）GelMA与5.3%（w/v）SilMA混合体系（含0.25% LAP）作为hESC-ECCs递送载体，主要基于其显著的损耗因子与低剪切模量特性。该水凝胶在405 nm紫外光照射下10秒内固化，满足了心内注射后快速凝胶化的需求。
二、人胚胎干细胞分化为内皮前体细胞、内皮细胞和心肌细胞
将人胚胎干细胞分化为内皮前体细胞、心肌细胞和内皮细胞（图2A和C）。在人胚胎干细胞-内皮前体细胞生成过程中（图2A），人胚胎干细胞经消化处理形成单细胞，随后采用胚胎体（EB）生成方案。ECC的代表性分化率达50.2%，与既往发表方案一致（图2D）。对于hESC-CM和hESC-EC的制备，将hESCs消化成单细胞后接种于包被培养板，通过调控Wnt信号通路诱导其全部转化为心肌前体细胞，随后分别采用VEGF信号激活方案（图2B）或代谢修饰纯化方案（图2C）制备hESC-CMs。hESC-ECs表达内皮细胞特征，呈CD31+且NKX2.5−（图2E）。心脏细胞的成功制备得以进一步探索hESC-ECCs在心肌梗死治疗中的潜在作用及机制。
三、水凝胶递送系统与ECCs具有良好的生物相容性
为评估系统生物相容性，对hESC-ECCs进行CD31和DAPI染色。结果显示，在共聚焦显微镜下观察到hESC-ECCs（CD31⁺且DAPI⁺）附着于水凝胶（红荧光⁺）表面（图3A）。通过扫描电子显微镜观察冻干后的细胞载水凝胶，发现hESC-ECCs被水凝胶包裹并附着于其网络结构上，呈现椭圆形形态（图3B）。
ECCs被封装于水凝胶中，并在LI-APEL培养基中培养。在细胞负载水凝胶中于第3、14和28天进行活/死细胞染色，结果显示多数ECCs在28天时仍存活（图3C）。经钙黄绿素AM染色后，发现hESC-ECCs在水凝胶中分布均匀（图3D）。这些结果证实hESC-ECCs附着于水凝胶的网络结构，且三维（3D）培养能使细胞保持更规整的椭圆形态。此外，相同体积预交联溶液中不同批次的细胞数量均匀性保持稳定（图3E），表明不同批次输送的细胞数量具有可控性。
四、水凝胶递送系统兼具 ECCs 体内生存环境供给能力与组织安全性
通过一系列体内实验进一步验证了水凝胶的安全性与递送效能。小鼠皮下植入实验显示，14天后水凝胶降解率达90%（图4A-B），表明其具有良好的体内清除能力。为探究人胚胎干细胞来源的ECCs在体内的存活率，将载有细胞的水凝胶植入小鼠皮下。于植入后第3、5、7及14天取出水凝胶（图4C）。结果显示植入14天后细胞存活率仍维持在10%（图4D）。为明确水凝胶递送系统的植入情况，将荧光标记或染料标记的水凝胶注入心包腔。荧光标记水凝胶在递送3天后可通过体内成像观察到（图4E），染料标记水凝胶则在7天后可见（图4F）。
五、人胚胎干细胞来源的心肌细胞（hESC-ECCs）可减轻心肌梗死后纤维化面积并改善心脏功能
实验设计如图5A和B所示。将水凝胶递送系统注入心包腔后，通过405 nm紫外光快速固化。左前降支结扎后心电图（ECG）显示明显T波抬高（图5C）。术后第2周和第4周进行超声心动图（ECHO）检测，术后第2周ECHO测量显示心肌梗死成功结扎，术后第4周ECHO数据表明细胞治疗组心脏功能改善（图5D）。对术后4周超声心动图数据的统计分析显示，细胞治疗组左心室射血分数（LVEF）和左心室收缩分数（LVFS）较水凝胶注射组（39% ± 6.2%， 19% ± 3.4%）及心肌梗死对照组（38% ± 9.2%，18% ± 4.9%）显著提升（图6A和D）。
马松染色（图6E）和HE染色（图6F）用于检测不同组别的纤维化区域。统计分析显示，细胞治疗组（12% ± 4.1%）的纤维化面积较水凝胶注射组（25% ± 6.7%）及心肌梗死对照组（23% ± 4.8%）显著降低（图6G）。
六、人胚胎干细胞来源的内皮细胞在心肌梗死后维持梗死区毛细血管存活
心肌梗死后，梗死区毛细血管数量显著减少。除冠状血管（α-SMA+和CD31+）外，大鼠心脏中还发现大量毛细血管（CD31+和α-SMA−）（图7A），但在心肌梗死组和水凝胶注射组中，梗死区检测到的毛细血管极少。细胞治疗组梗死区毛细血管数量显著高于另两组（图7B）。
七、hESC-ECCs 增强 hESC-CMs 抗氧化应激、促其迁移，并推动自身内皮相关进程
为探究hESC-ECCs（人胚胎干细胞来源的内皮细胞）对心肌梗死（MI）的治疗机制，采用Transwell板将hESC-CMs（人胚胎干细胞来源的心肌细胞）与hESC-ECCs共培养以模拟治疗后细胞间的关联，用H₂O₂模拟MI后心肌组织周围的氧化应激环境（图8A）。结果显示，经hESC-ECCs共培养后，多数hESC-CMs在H₂O₂处理下仍保持正常形态，统计分析表明其存活率显著高于对照组（图8B和C）。透射电子显微镜观察显示，经H₂O₂处理的hESC-CMs线粒体严重受损，线粒体嵴消失并产生大量空泡。而与hESC-ECCs共培养时，hESC-CMs线粒体形态正常，可见线粒体嵴且空泡显著减少（图8C）。
此外，研究者评估了人胚胎干细胞来源的内皮细胞（hESC-ECs）对内皮功能的影响。细胞划痕实验表明，与hESC-ECs共培养的人胚胎干细胞来源的内皮细胞（hESC-ECs）相比，对照组细胞的迁移率显著降低（图8D-E）。管腔形成实验进一步表明，与hESC-ECCs共培养的hESC-ECs在节点和连接点数量、总分支长度及主分支段数量方面均显著优于对照组（图8F和J）。这些发现提示，hESC-ECCs对心肌梗死（MI）的心脏保护作用可能部分通过增强内皮细胞功能实现。
八、结论
综上所述，研究者采用GelMA和SilMA制备了水凝胶递送系统，通过心包腔内注射载入人胚胎干细胞来源的心内皮细胞（hESC-ECCs）治疗心肌梗死（MI）。该递送系统与hESC-ECCs具有良好的生物相容性，并具备适用于心脏组织的优良力学性能。本研究证实hESC-ECCs作为新型细胞具有治疗心肌梗死的功效：通过缩小梗死区纤维化范围、促进毛细血管新生，改善心肌梗死后的心脏功能。后续研究表明，hESC-ECCs能保护hESC-CMs线粒体免受氧化应激损伤，并增强hESC-ECs的血管生成与迁移能力，为hESC-ECCs治疗心肌梗死的机制提供了初步依据。
通讯作者简介
陈昕博士，现任陆军军医大学药学院药剂系药物研究所研究员 / 副教授，为药物递送系统与免疫治疗交叉领域骨干研究者。2009 年特招入伍入职原第三军医大学药学院，现牵头或核心参与多项跨学科项目。研究聚焦药物递送系统转化、多肽药物与免疫治疗协同、军民融合药物研发，参与国家级、军队级项目 5 项以上，申请发明专利 5-8 项。
文章信息
Liu B, Zhang L, Guan X, Liu J, Shou W, Chen X, Li X, Cao D. Interpenetrating network hydrogel-loaded embryonic stem cell-derived endocardial cells improves cardiac function after myocardial infarction. J Transl Med. 2025 May 30;23(1):603. doi: 10.1186/s12967-025-06603-2. PMID: 40448180; PMCID: PMC12125831.
原文链接
https://doi.org/10.1186/s12967-025-06603-2 |
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